Hi ha una gran varietat de mètodes per aconseguir fer un transgènic, concretament s´introdueix un gen a una planta, perquè aquesta pugui produir una proteïna que per la seva naturalesa no pot produir.
Aquests mètodes de transferència es poden dividir en dos grups: els mètodes biològics i els directes.
En els mètodes biològics, s´usa un vector viu que duu el material genètic a la cèl.lula. En aquesta transformació intervenen l´Agrobacterium i la transducció viral.
En segon lloc, entre els mètodes directes més utilitzats es troben el bombardeig per una partícula (“biolistics”), la transformació del cloroplast, la tècnica “Galistan” (injecció), l´enginyeria metabòlica i el cultiu de cèl.lules en plantes. Aquests són els mètodes més eficients i segurs per poder dur a terme el procés de transformació.
La tècnica de transformació genètica on intervé l´Agrobacterium tumefaciens va establir les bases per a la creació de les plantes transgèniques i la gran varietat d´aplicacions que aquesta tecnologia proveeix. De forma general, aquesta consisteix en el intercanvi genètic per mitjà de calls que li causen a la planta. És el mètode que més s´usa.
A continuació, tenim el mètode de infiltració d´Agrobacterium al buit o vacuum, és relativament nou i senzill, usat per a la transformació de Arabidopsis thaliana. Aquesta tècnica, coneguda també com “Floral Dipping”, simplifica el mètode tradicional de la transformació on intervé l´Agrobacterium. Els passos a seguir, en aquest procés, són els següents :
1. Cultiu d´Arabidopsis fins que floreixi.
2. Remoción o “uprooting” de la planta.
3. Aplicació de l´Agrobacterium a través d´una infiltració al buit en un medi de sacaroa/hormones.
4. Replantació de la planta.
5. Recol.lecció de les llavors després d´unes setmanes de cultiu.
6. Identificació de la peogenie desitjada al créixer selectivament en un medi d´antibiòtics o herbicides.
Amb aquest mètode és minimitza la variació somaclonal associada amb el cultiu i la regeneració de teixits, atès que la majoria de la peogenie transformada és genèticament uniforme(no-quimèrica)de la transducció viral, la transferència de l´ADN viral d´una cèl.lula a una altra per un bacteriògag. L´avantatge d´aquest mètode és que com el genoma manipulat és transferit per un bacteriòfag a una altra cèl.lula hoste, aquest quedarà inscrit en el mode de replicació d´ADN de la cèl.lula infectada i, por tant, produirà nombroses còpies d´ADN recombinant augmentant l´expressió d´una proteïna en un temps relativament curt.
Entre altres mètodes de transferència directa la més usada és el bombardeig per una partícula o “Biolistics”. Aquesta tècnica envolta l´ús d´una partícula (usualment de metall) coberta d´una capa d´àcid nucleòtid, la qual és projectada a una cèl.lula o teixit dirigit a grans partícules. L´ADN es desprèn a l´interior de la cèl.lula, i una porció s´incorporarà als cromosomes de l´hoste. En un experiment d´aquest tipus normalment es generaran 8,000 “tirs” per plat bombardejat. És considerat com la forma més estable d´insercció del gen al genoma nuclear de la planta, a més a més de la tècnica d´Agrobacterium. Però, alguns desavantatges són que proveeix un ampli marge de resultats imprescindibles i incrementa la taxa de mutació cel.lular.
L´insercció del genoma forà per mitjà del genoma separat del cloroplast es pot fer per tres mètodes:
1. “biolistics”
2. Transformació on intervé el glicol de polietilè (PEG)
3. Expansió “Galistan” per una femto-agulla
La transformació on intervé el PEG requereix la preparació del protoplast (la cèl.lula vegetal sense la paret). Els protoplasts es fusionen mitjançant el PEG, s´obtenen híbrids i , per recombinació, cèl.lules transgèniques. A més, també requereix que la proteïna sigui regenerable per si mateix. El cloroplast adquireix ADN en presència de PEG per canvis a la membrana plasmàtica, de manera que aquest entra al citoplasma i és transportat al cloroplast on és afegit com a part integral del seu genoma original. Després, com el cloroplast és part essencial del procés fotosintètic, totes les plantes tenen múltiples còpies d´ells, factor que ajuda en alts nivells d´expressió.
La tècnica “Galistan” és la més nova i per tant, la menys practicada. Tracta de la microinjecció d´ADN al cloroplast usant l´expansió d´un líquid dins de l´agulla inducido pel calor (“Galistan”) que obliga la transformació del plásmido d´ADN dirigit. També s´usa la tècnica de injecció, a nivell macro i micro, per inserir el material genètic forà directament al nucli de la cèl.lula. Aquest mètode presenta menys errors aleatoris per la seva eficàcia.
L´enginyeria metabòlica tracta sobre la modificació de processos metabòlics de les cèl.lules enfocats en canviar gens estructurals i gens regulatoris, com els gens que codifiquen pels promotors. Al modificar un promotor es pot controlar no tant sols la quantitat de proteïna sintetizada, sinó que es pot controlar l´acumulació d´aquesta proteïna en àrees específiques a la cèl.lula de la planta.
Finalment, l´últim mètode usat és la producció de proteïnes pel cultiu de cèl.lules. En aquests projectes, usualment, insereixen ADN a la cèl.lula de la planta i creixen en un cultiu dins d´un caldo nutricional. D´aquesta forma, les cèl.lules produeixen ràpidament la proteïna i aquesta és rebutjada al medi, on la seva extracció és més senzilla. Tot i així, hi ha cops que es requereix d´un equip sofisticat per a una extracció efectiva, com un bioreactor que separa les proteïnes per cromatografia d´afinitat després de què aquestes hagin estat sintetitzades (“Affinity-Chromatography Bioreactor” o ACBR)
No hay comentarios:
Publicar un comentario